肝胰脏及肾脏特异性标记转基因斑马鱼

       脊椎动物的器官形成是一个错综复杂的发育过程。斑马鱼胚胎通体透明的优势，加上转基因模型所提供的组织特异荧光蛋白表达使得研究者能够对研究目标进行标记和实时观察，这就像黑暗中的灯光照亮了鱼类内脏团中器官发育、免疫应答、疾病防治中难以观察到的细节。因此，带有荧光报告系统的胰脏、肝脏、肾脏等转基因斑马鱼对于这些研究的快速发展具有重要作用。

       斑马鱼胰脏和肝脏都起源于早期胚胎发育中的内胚层细胞。位于背侧的内胚层细胞分化成胰腺组织，而位于腹侧的内胚层分化成肝芽[1]。发育成胰腺组织的内胚层结构分别被称为背芽（DB）和腹芽（VB）。其中，DB于24hpf在肠道的背部面上完成形态建成，早期形成的胰内细胞在那里聚集形成初级胰岛；34hpf后位于胰岛前端的一群肠道细胞形成VB，随后VB细胞逐渐形成胰外分泌腺、胰管和部分胰内细胞（图1）[2]。斑马鱼早期肝脏形成可分为芽生期和生长期，24~28hpf，迁移至斑马鱼咽部后方的内胚层细胞聚集变厚，逐渐形成肝芽雏形，在随后的6~10小时内，肝管将肝脏和食道、肠道等其它消化器官链接起来完成肝芽发生；50~96hpf，肝芽和成肝细胞进一步增值、分化形成肝细胞、胆管细胞以及左右肝叶（图1 ）[3]。斑马鱼肠管也起源于内胚层，形成始于体节中期至后期（18体节），26~126hpf，斑马鱼肠道的管腔形成并不断的生长，内胚层分化出连续的有功能的肠道上皮，从形态上可以分为3 段(肠球、中肠和后肠)[4, 5]。

 

       而斑马鱼的肾脏起源于中胚层，其发育经历前肾和中肾两个阶段，其肾元和哺乳动物的后肾在结构和功能上非常相似。前肾起源于鱼体两侧条状胚层的肾祖细胞，80dpf后发育成熟，是斑马鱼胚胎和幼鱼阶段的功能性泌尿器官。中肾在12-14dpf开始形成，前肾随之在30~60dpf退化。中肾发育成熟后，后续生命过程中还会不断有新的肾元产生，以适应体重增加和损伤后修复需要（ 图2 ）[7]。

       国家斑马鱼资源中心多年来收集并保存了多个肝脏、胰脏、肾脏表达荧光蛋白的转基因品系，已经在中心网站发布，现做一归纳汇总，方便广大科研工作者更好的开展工作，具体清单请见文末，现就常用品系逐一进行介绍。

       首先介绍胰脏特异性标记的荧光品系。CZ15 (rj29Tg, Tg(ins:EGFP))和CZ72 (jh2Tg, Tg(ins:mCherry))。这两个品系均为斑马鱼胰岛素preproinsulin（ins）启动子序列特异性在胰腺中驱动胰岛β细胞持续性表达绿色或者红色荧光蛋白（ 图3/4 ）[9, 10]。它们从胚胎胰腺发育初期直至成鱼期，都可以特异性标记胰岛β细胞，因此被广泛应用于追踪胰腺器官发生以及胰岛β细胞发生的全部过程。

图4 CZ72 (jh2Tg,Tg(ins:mCherry))

       接着介绍肝脏特异性标记的荧光品系。CZ320/CZ321(ihb175Tg, Tg(-1.7apoa2:GFP))和(ihb176Tg, Tg(-1.7apoa2:RFP))这两个品系其实都是由斑马鱼14kDa阿朴脂蛋白（Apo-14）启动子序列驱动绿色/红色荧光蛋白报告基因表达的转基因斑马鱼（ 图5/6 ）[11]。由于Apo-14启动子驱动的绿色/红色荧光蛋白持续地表达在肝原基和成鱼肝脏中的成肝细胞、肝祖细胞和肝细胞中，因此这两个品系可以详细观察记录肝脏器官发生的动态过程，为研究肝脏发育及其器官发生提供了一个从早期内胚层细胞直到完整的肝脏器官形成都可观察的转基因工具。

图5 CZ320 (ihb175Tg, Tg(-1.7apoa2:GFP))

图6 CZ321 (ihb176Tg, Tg(-1.7apoa2:RFP))

       此外，CZRC还保存有肝胰脏双标记斑马鱼品系。CZ16(gz15Tg, Tg(fabp10a:dsRed;ela3l:EGFP)) 该品系为一个双色荧光转基因斑马鱼。该品系中采用斑马鱼肝脏脂肪酸结合蛋白（fabp10a）启动子序列驱动红色荧光蛋白在肝脏中表达，同时串联有胰腺弹性蛋白酶3（ ela3l）启动子驱动绿色荧光蛋白在胰腺中表达（ 图7 ）[12]。因此它是一个重要的，可以同时研究肝胆胰腺多器官发生和器官边界的类器官模型。例如，曾有研究通过正向筛查该品系背景下的DNA甲基转移酶（dnmt1）基因突变体中的胰腺和肝脏器官形态变化，确认了在dnmt1突变体中胰腺和肝脏能正常形成，但在84hpf后胰腺和肝脏开始退化；说明了dnmt1基因对于胰管及其它内分泌细胞的形成是必需的，但对于腺泡细胞的生存却不是必需的[13]。

 
图7 CZ16 (gz15Tg, Tg(fabp10a:dsRed;ela3l:EGFP))

       最后介绍肾脏特异性标记的荧光品系。CZ104 (ihb50Tg，Tg(Eco.Tshb:EGFP))该品系为石斑鱼促甲状腺激素thyroid-stimulating hormoneβ-subunit (tshβ) 启动子序列驱动绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)在肾小管特异性表达（ 图9 ）[14]。于斑马鱼的内源性tshβ类似，gtshβ(石斑鱼tshβ)序列也可以驱动GFP在垂体和肾脏中表达，近端肾小管的发育细节在该转基因斑马鱼品系中得到了标记。因此，该品系成为了研究肾小管发育以及了解石斑鱼tshβ基因功能及其分布的重要工具。

图9 CZ104 (ihb50Tg, Tg(Eco.Tshb:EGFP) )[16]

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