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肠道、肝胰脏及肾脏特异性标记转基因斑马鱼

作者:zhangyun 发布时间:2020/7/20 10:00:00
撰文 | 柳力月
编辑 | 潘鲁湲

       脊椎动物的器官形成是一个错综复杂的发育过程。斑马鱼胚胎通体透明的优势,加上转基因模型所提供的组织特异荧光蛋白表达使得研究者能够对研究目标进行标记和实时观察,这就像黑暗中的灯光照亮了鱼类内脏团中器官发育、免疫应答、疾病防治中难以观察到的细节。因此,带有荧光报告系统的肠道、胰脏、肝脏、肾脏等转基因斑马鱼对于这些研究的快速发展具有重要作用。


       斑马鱼胰脏和肝脏都起源于早期胚胎发育中的内胚层细胞。位于背侧的内胚层细胞分化成胰腺组织,而位于腹侧的内胚层分化成肝芽[1]。发育成胰腺组织的内胚层结构分别被称为背芽(DB)和腹芽(VB)。其中,DB于24hpf在肠道的背部面上完成形态建成,早期形成的胰内细胞在那里聚集形成初级胰岛;34hpf后位于胰岛前端的一群肠道细胞形成VB,随后VB细胞逐渐形成胰外分泌腺、胰管和部分胰内细胞(图1)[2]。斑马鱼早期肝脏形成可分为芽生期和生长期,24~28hpf,迁移至斑马鱼咽部后方的内胚层细胞聚集变厚,逐渐形成肝芽雏形,在随后的6~10小时内,肝管将肝脏和食道、肠道等其它消化器官链接起来完成肝芽发生;50~96hpf,肝芽和成肝细胞进一步增值、分化形成肝细胞、胆管细胞以及左右肝叶(图1 )[3]。斑马鱼肠管也起源于内胚层,形成始于体节中期至后期(18体节),26~126hpf,斑马鱼肠道的管腔形成并不断的生长,内胚层分化出连续的有功能的肠道上皮,从形态上可以分为3 段(肠球、中肠和后肠)[4, 5]。


 
图1 5dpf 斑马鱼胚胎消化系统模式示意图( Ph :咽, L :肝脏, P :胰腺, Pi: 胰岛, G :胆囊, SB :鱼鳔, I :肠道) [ 6 ]


       而斑马鱼的肾脏起源于中胚层,其发育经历前肾和中肾两个阶段,其肾元和哺乳动物的后肾在结构和功能上非常相似。前肾起源于鱼体两侧条状胚层的肾祖细胞,80dpf后发育成熟,是斑马鱼胚胎和幼鱼阶段的功能性泌尿器官。中肾在12-14dpf开始形成,前肾随之在30~60dpf退化。中肾发育成熟后,后续生命过程中还会不断有新的肾元产生,以适应体重增加和损伤后修复需要( 图2 )[7]。



图2 斑马鱼胚胎肾脏模式示意图( G ,肾小球 N ,颈段; PCT ,近曲小管; PST ,近端直小管; DE ,远端早期肾小管; DL ,远端晚期肾小管; C ,泄殖腔) [ 8 ]

       国家斑马鱼资源中心多年来收集并保存了多个肝脏、胰脏、肾脏表达荧光蛋白的转基因品系,已经在中心网站发布,现做一归纳汇总,方便广大科研工作者更好的开展工作,具体清单请见文末,现就常用品系逐一进行介绍。


       首先介绍胰脏特异性标记的荧光品系。CZ15 (rj29Tg, Tg(ins:EGFP))和CZ72 (jh2Tg, Tg(ins:mCherry))。这两个品系均为斑马鱼胰岛素preproinsulinins)启动子序列特异性在胰腺中驱动胰岛β细胞持续性表达绿色或者红色荧光蛋白 图3/4 )[9, 10]。它们从胚胎胰腺发育初期直至成鱼期,都可以特异性标记胰岛β细胞,因此被广泛应用于追踪胰腺器官发生以及胰岛β细胞发生的全部过程。



图 3 CZ15 (rj29Tg, Tg(-1.2ins:EGFP))

4 CZ72 (jh2Tg,Tg(ins:mCherry))


       接着介绍肝脏特异性标记的荧光品系。CZ320/CZ321(ihb175Tg, Tg(-1.7apoa2:GFP))和(ihb176Tg, Tg(-1.7apoa2:RFP))这两个品系其实都是由斑马鱼14kDa阿朴脂蛋白(Apo-14)启动子序列驱动绿色/红色荧光蛋白报告基因表达的转基因斑马鱼( 图5/6 )[11]。由于Apo-14启动子驱动的绿色/红色荧光蛋白持续地表达在肝原基和成鱼肝脏中的成肝细胞、肝祖细胞和肝细胞中,因此这两个品系可以详细观察记录肝脏器官发生的动态过程,为研究肝脏发育及其器官发生提供了一个从早期内胚层细胞直到完整的肝脏器官形成都可观察的转基因工具。



5 CZ320 (ihb175Tg, Tg(-1.7apoa2:GFP))



6 CZ321 (ihb176Tg, Tg(-1.7apoa2:RFP))


       此外,CZRC还保存有肝胰脏双标记斑马鱼品系。CZ16(gz15Tg, Tg(fabp10a:dsRed;ela3l:EGFP)) 该品系为一个双色荧光转基因斑马鱼。该品系中采用斑马鱼肝脏脂肪酸结合蛋白(fabp10a)启动子序列驱动红色荧光蛋白在肝脏中表达,同时串联有胰腺弹性蛋白酶3 ela3l启动子驱动绿色荧光蛋白在胰腺中表达 图7 )[12]。因此它是一个重要的,可以同时研究肝胆胰腺多器官发生和器官边界的类器官模型。例如,曾有研究通过正向筛查该品系背景下的DNA甲基转移酶(dnmt1)基因突变体中的胰腺和肝脏器官形态变化,确认了在dnmt1突变体中胰腺和肝脏能正常形成,但在84hpf后胰腺和肝脏开始退化;说明了dnmt1基因对于胰管及其它内分泌细胞的形成是必需的,但对于腺泡细胞的生存却不是必需的[13]。


 
7 CZ16 (gz15Tg, Tg(fabp10a:dsRed;ela3l:EGFP))



      接下来介绍下肠道特异性标记的荧光品系。CZ336 (ip1Tg, Tg(ifnphi1:mCherry))该品系为斑马鱼干扰素α1(ifnφ1)启动子序列驱动红色荧光蛋白报告基因(mCherry)在肠道中特异性表达(图8[14]I型干扰素信号对于控制哺乳动物的CHIKV病毒感染至关重要[15],而该病毒在斑马鱼中也可诱发强烈的ifnφ1表达,因此,该品系可以更好地可视化CHIKV感染过程中IFN产生的时空动态,也为其它病毒发病机理的研究提供了新思路[14]。



图8 CZ336  (ip1Tg, Tg(ifnphi1:mCherry))


       最后介绍肾脏特异性标记的荧光品系。CZ104 (ihb50TgTg(Eco.Tshb:EGFP))该品系为石斑鱼促甲状腺激素thyroid-stimulating hormoneβ-subunit (tshβ) 启动子序列驱动绿色荧光蛋白报告基因(EGFP)在肾小管特异性表达( 图9 )[16]。于斑马鱼的内源性tshβ类似,gtshβ(石斑鱼tshβ)序列也可以驱动GFP在垂体和肾脏中表达,近端肾小管的发育细节在该转基因斑马鱼品系中得到了标记。因此,该品系成为了研究肾小管发育以及了解石斑鱼tshβ基因功能及其分布的重要工具。



图9 CZ104 (ihb50Tg, Tg(Eco.Tshb:EGFP) )[16]


       欢迎点击下表中CZ编号进行查看。有问题欢迎随时致电或发邮件到CZRC工作邮箱查询。


CZ Number

Line Name

Construct

Note

CZ15

rj29Tg/+

Tg(-1.2ins:EGFP)

endocrine pancreas B cells

CZ16

gz15Tg/+

Tg(fabp10a:dsRed;ela3l:EGFP)

exocrine pancreas; liver

CZ72

jh2Tg/+

Tg(ins:mCherry)

endocrine pancreas B cells

CZ104

ihb50Tg/+

Tg(Eco.Tshb:EGFP)

pronephric neck and tubule

CZ320

ihb175Tg/+

Tg(-1.7apoa2:GFP) 

liver 

CZ321

ihb176Tg/+

Tg(-1.7apoa2:RFP)

liver 

CZ336

ip1Tg/+

Tg(ifnphi1:mCherry)

intestine


参考文献
1. Ward AB, Warga RM, Prince VE. Origin of the zebrafish endocrine and exocrine pancreas. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists, 2007, 236: 1558-1569
2. Field HA, Dong PD, Beis D, et al. Formation of the digestive system in zebrafish. Ii. Pancreas morphogenesis. Developmental biology, 2003, 261: 197-208
3. Wang S, Miller SR, Ober EA, et al. Making it new again: Insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current topics in developmental biology, 2017, 124: 161-195
4. Ng AN, de Jong-Curtain TA, Mawdsley DJ, et al. Formation of the digestive system in zebrafish: Iii. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmental biology, 2005, 286: 114-135
5. 陈秋生 林章姚高胡. 斑马鱼肠道显微和超微结构的研究. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2013, 45: 60-65
6. Wallace KN, Pack M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Developmental biology, 2003, 255: 12-29
7. Zhou W, Boucher RC, Bollig F, et al. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. American journal of physiology Renal physiology, 2010, 299: F1040-1047
8. Morgan Prochaska JL, Kenneth N. Wallace. The zebrafish in biomedical research. Academic Press, 2020. 
9. Dong PD, Munson CA, Norton W, et al. Fgf10 regulates hepatopancreatic ductal system patterning and differentiation. Nature genetics, 2007, 39: 397-402
10. Pisharath H, Rhee JM, Swanson MA, et al. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using e. Coli nitroreductase. Mechanisms of development, 2007, 124: 218-229
11. Wang R, Li Z, Wang Y, et al. An apo-14 promoter-driven transgenic zebrafish that marks liver organogenesis. PloS one, 2011, 6: e22555
12. Xu PF, Zhu KY, Jin Y, et al. Setdb2 restricts dorsal organizer territory and regulates left-right asymmetry through suppressing fgf8 activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107: 2521-2526
13. Anderson RM, Bosch JA, Goll MG, et al. Loss of dnmt1 catalytic activity reveals multiple roles for DNA methylation during pancreas development and regeneration. Developmental biology, 2009, 334: 213-223
14. Palha N, Guivel-Benhassine F, Briolat V, et al. Real-time whole-body visualization of chikungunya virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens, 2013, 9: e1003619
15. Couderc T, Chretien F, Schilte C, et al. A mouse model for chikungunya: Young age and inefficient type-i interferon signaling are risk factors for severe disease. PLoS pathogens, 2008, 4: e29
16. Wang Y, Sun ZH, Zhou L, et al. Grouper tshbeta promoter-driven transgenic zebrafish marks proximal kidney tubule development. PloS one, 2014, 9: e97806



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