当前位置：首页 > 详细信息 罗凌飞团队开发在斑马鱼胚胎及幼鱼全鱼中高灵敏高分辨率同时检测多个因子原位表达的技术体系
作者：luojiao 发布时间：2021/4/1 11:00:00撰文 | 何建波
图1 斑马鱼皮肤剥离流程
图2 斑马鱼幼鱼期脑膜淋巴管特异标记基因mrc1a的表达模式（红色：脑膜淋巴管；蓝色：脑血管）
西南大学生命科学学院何建波副研究员和博士生莫大双为论文的共同第一作者，罗凌飞教授为论文的通讯作者。
脊椎动物斑马鱼作为模式动物在器官早期发育和后期再生修复研究中得到越来越广泛的应用。而鉴定特定基因在器官发育和再生中的时空表达模式对于深入揭示其生理功能至关重要。整胚原位杂交（Whole-mount in situ hybridization, WISH）和荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）常用于检测斑马鱼胚胎期的基因表达；抗体染色/免疫荧光(antibody staining/ immunofluorescence, IF)常用于检测目标蛋白的表达及亚细胞定位。但到目前为止，在斑马鱼中工作的抗体非常有限；此外，RNA探针在斑马鱼晚期胚胎和幼鱼中难以渗透进入致密的组织，常规的WISH和FISH很难在斑马鱼晚期胚胎和幼鱼中工作。因此，斑马鱼器官发育后期和再生修复中功能基因时空表达的检测还存在困难，同时限制了斑马鱼作为重要模式动物研究器官发育和再生的优势。
2020年9月10日，西南大学罗凌飞和何建波团队在Nature Protocols上在线发表了题为Combined whole-mount fluorescence in situ hybridization and antibody staining in zebrafish embryos and larvae的研究论文。团队发展并优化了在斑马鱼胚胎及幼鱼全鱼中同时检测多个基因/蛋白表达的高分辨原位检测技术，利用该技术能够在斑马鱼幼鱼中同时检测最多四种基因/蛋白的表达，这种技术在受精后20天的幼鱼全鱼中工作正常。该方法极大地弥补了斑马鱼中工作抗体不足的缺陷并拓展了斑马鱼作为模式动物研究器官发育和再生的时期。
图1 斑马鱼皮肤剥离流程
该论文将FISH和IF相结合并能够同时检测三种或四种mRNA/蛋白在全鱼中的表达。在该方法中，FISH在IF之前操作以防止组织中mRNA在IF实验过程中被降解；利用人工去除皮肤（图1）和TritonX-100处理代替传统的蛋白酶K来增强胚胎渗透性同时保存完整的抗原表位；利用PCR合成的探针模板合成RNA探针并避免探针在转基因斑马鱼中的非特异结合；利用高强度的洗脱液对非特异性结合的RNA探针进行洗脱并减少了背景信号。该方法的FISH和IF均产生荧光信号，通常以confocal作为检测手段，与传统WISH相比，能够以高灵敏、高分辨（甚至单细胞水平）在斑马鱼全鱼中同时检测多个mRNA和蛋白的表达，进而开展它们共定位研究。
该技术在胚胎发育早期、晚期和幼鱼期均能够正常工作，对组织也没有选择性。在斑马鱼幼鱼期内胚层来源的肝胰肠系统、中胚层来源的淋巴-血管系统（图2）、外胚层来源的中枢神经系统中得到验证；对于皮肤表达的基因可以不用去除皮肤便可得到理想的结果；对深层组织（肌肉、脊索等）仍然工作良好。
图2 斑马鱼幼鱼期脑膜淋巴管特异标记基因mrc1a的表达模式（红色：脑膜淋巴管；蓝色：脑血管）
该方法操作时间大约6天，步骤简单易行，试剂容易获得，可以表征蛋白的亚细胞定位，克服了斑马鱼研究中缺乏可靠抗体的问题，加上高灵敏、高分辨、可同时检测多个基因/因子表达、无组织选择性、工作时期可达20多天幼鱼等一系列优点，成为在斑马鱼中研究原位基因表达的强大技术方法。
西南大学生命科学学院何建波副研究员和博士生莫大双为论文的共同第一作者，罗凌飞教授为论文的通讯作者。