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比利时科学家利用斑马鱼筛选设计出工程化改造的Wnt配体用于修复血脑屏障损伤

作者:luojiao 发布时间:2022/6/28 4:00:00
中枢神经系统在血液和脑组织的界面上具有一个选择性的过滤屏障,这一结构被称为血脑屏障(BBB),血脑屏障在早期胚胎发育过程中逐渐建立,并通过功能整合的神经血管单元来维持大脑内环境的稳态。在很多中枢神经系统疾病中,神经血管微环境被破坏,因此会出现液体、分子和细胞的过度浸润,从而导致疾病恶化。血脑屏障功能障碍表现为不同程度的脑血管高通透性、神经血管解偶联或血流失调;其与中风、胶质瘤、癫痫、外伤性脑损伤和神经退行性疾病有关[1-3]。血脑屏障破裂时,神经毒性血浆成分渗漏、免疫细胞浸润和中枢神经系统环境改变。但血脑屏障又是多种疾病治疗的“魔障”,由于分子选择性的存在很难使得药物发挥作用。因此,需要一定的治疗策略来修复受损的血脑屏障功能。为此,比利时布鲁塞尔自由大学Benoit Vanhollebeke研究组在Science发文题为Engineered Wnt ligands enable blood-brain barrier repair in neurological disorders,通过工程化的Wnt配体的方式促进神经功能障碍疾病中血脑屏障的的修复。


在多种控制神经血管功能的信号途径中,内皮细胞Wnt/β-catenin信号通路作为血脑屏障生理的主要调节因子发挥作用,它在中枢神经系统血管侵袭的早期阶段启动血脑屏障分化级联信号途径,并在健康和疾病中维持血脑屏障功能。而血脑屏障成熟过程则是由Wnt7a/b配体所控制的[4-6]。因此,Wnt7a/b配体修复功能失调血脑屏障以及促进成熟的功能成为了药物开发的靶点。但是由于Wnt7a/b在体内能够与Frizzled受体混杂相互作用,会导致器官改变、干细胞异常扩增以及肿瘤发生等等不良后果,比如当Wnt7a在非洲爪蟾或斑马鱼胚胎中表达时,分别会导致前神经系统的轴复制等,最终导致畸形发生。因此想要将Wnt7a/b为药所用还有很长的一段路要走。

在大脑的内皮细胞中有一个非典型的的Wnt7a/b特异性共受体复合物,在脑血管生成和血脑屏障调节过程中激活Wnt/β-catenin信号通路,其中含有糖基磷脂酰肌醇锚定型糖蛋白Reck和粘附G蛋白偶联受体Gpr124,该复合体对Wnt7a/b具有高度特异性,为此作者们考虑是否可以通过该复合体的组装协同刺激Wnt7a/b特异性反应,而不引起其他的副作用。

因此,血脑屏障药物开发的目标可以由Wnt7a/b转化为找到Gpr124/ Reck的特异性激动剂(图1)。通过对Wnt7a进行系统性突变,作者们发现改变Wnt配体的结构可以调节其信号特异性,更具体地说,Wnt7a可以被设计成Gpr124/Reck特异性配体或者说激动剂。基于此概念,作者们找到一个目标突变Wnt7aK190A。该突变的注射不会引发爪蟾或者斑马鱼体轴的改变。


图1 鉴定发现Gpr124/ Reck的特异性激动剂

随后,作者们对Wnt7aK190A进行评估,发现这一突变会影响其与Fz的相互作用,与此同时也提高了其稳定性以及活性的维持,Gpr124/Reck会将Wnt7a/b招募到一个高阶受体复合体中。为了对Wnt7aK190A在体内的功能活性进行检测,作者们构建了一个具有遗传缺陷的斑马鱼模型。作者们敲除了Wnt7aa,该品系的斑马鱼表现出脑血管和背根神经节神经发生缺陷(图2),而这一缺陷可以通过一细胞期Wnt7aK190A mRNA注射而挽救,但是相同量的Wnt7a则具有毒性。通过血脑屏障成熟的细胞标记物染色,作者们进一步确认Wnt7aK190A可以恢复血脑屏障的正常成熟过程。


图2 Wnt7aa敲除斑马鱼品系表现出脑血管等缺陷

进一步的, 作者们想知道Gpr124/Reck的激动剂能否在小鼠中发挥作用。为此,作者们使腺病毒相关病毒分别表达了Wnt7a以及Wnt7aK190A。作者们发现与Wnt7aK190A相比,Wnt7a会引发额外的Wnt/β-catenin信号通路活性。通过在多形性胶质母细胞瘤以及中风缺血模型中递送Gpr124/Reck激活剂,作者们证明Wnt7aK190A的确能够恢复血脑屏障损伤后的功能,恢复Wnt信号同路以及降低血管密度。

总的来说,作者们通过大规模的诱导鉴定发现了高度特异性活性的Gpr124/Reck激动剂Wnt7aK190A,该突变型Wnt7a在体内耐受性良好,不会导致副作用,并且在脑肿瘤和缺血性中风小鼠模型中对血脑屏障功能恢复具有明显作用(图3)。该研究揭示了Wnt配体的信号特异性的可调节性,并发现了一种通过调节血脑屏障功能的方式来治疗神经系统疾病的方法,为中风、多发性硬化症、癫痫、阿尔茨海默氏症等神经退行性疾病等中枢神经系统疾病的治疗提供新的参考。


图3 工作模型:Wnt7aK190A配体用于血脑屏障治疗

由于该工作在临床治疗方面的巨大前景,同期刊发了观点文章对其进行评价,题为Repairing the blood-brain barrier,Wnt7a的单个氨基酸改变显著增加了其对血管内皮细胞的特异性,从而改善了斑马鱼和肿瘤生长和中风时血脑屏障破坏的小鼠模型的预后,同时该工作也创造了一种新的药物开发思路。


参考文献:
1. B. Obermeier, R. Daneman, R. M. Ransohoff, Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat. Med. 19, 1584–1596 (2013). doi: 10.1038/nm.3407; pmid: 24309662
2. B. W. Chow, C. Gu, The molecular constituents of the blood brain barrier. Trends Neurosci. 38, 598–608 (2015). doi: 10.1016/j.tins.2015.08.003; pmid: 26442694
3. Z. Zhao, A. R. Nelson, C. Betsholtz, B. V. Zlokovic, Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell 163, 1064–1078 (2015). doi: 10.1016/j.cell. 2015.10.067;  pmid: 26590417
4. J. M. Stenman et al., Canonical Wnt signaling regulates organ specific assembly and differentiation of CNS vasculature. Science 322, 1247–1250 (2008). doi: 10.1126/ science.1164594;  pmid: 19023080
5. Y. Wang et al., Norrin/Frizzled4 signaling in retinal vascular development and blood brain barrier plasticity. Cell 151, 1332–1344 (2012). doi: 10.1016/j.cell.2012.10.042; pmid: 23217714
6. J. E. Lengfeld et al., Endothelial Wnt/b-catenin signaling reduces immune cell infiltration in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 114, E1168–E1177 (2017). doi: 10.1073/pnas.1609905114; pmid: 28137846
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