美国科学家揭示脊椎动物肌细胞融合突触的细胞结构和分子决定因素

2022年6月15日， Elizabeth Chen教授实验室在Developmental Cell上发表了文章“The cellular architecture and molecular determinants of the zebrafish fusogenic synapse”（斑马鱼融合突触的细胞结构和分子决定因素），继在发现果蝇肌细胞融合时产生的 PLS 结构后，在斑马鱼模型中首次报道了脊椎动物肌细胞运用类似于 PLS 的丝状肌动蛋白驱使的突起（F-actin-propelled protrusions）来促进细胞融合。

首先，作者们在斑马鱼受精后19.5-24小时胚胎中发现，鬼笔环肽染色标记后可视的丝状肌动蛋白焦点（F-actin focus）与快肌发育过程同步发生 (图1A)。非常有意思的是，可视的F-actin foci 数量有规律地遵循从体节的前部到后部渐进式增加，在躯干中部达到峰值后又逐渐递减，其分布特征类似钟罩的形状 (图1B)。活体胚胎成像实验揭示了F-actin focus 出现在斑马鱼快肌细胞融合处 (图1C-D)，并清晰捕捉到肌细胞融合时形成的入侵突出结构（invasive protrusions structure）(图1F)。研究者还鉴定出了三种不同类型的F-actin foci, 分别命名为fusion foci，aborted fusion foci 和 fusion-irrelevant foci， 三者在 foci 大小和存在的时间上都呈现显著差异 ，即 fusion foci 大小和生命周期上远远大于后两者，aborted fusion foci 次之。

    

此外研究者们通过电镜技术，清晰地呈现了这一入侵突触类似于手指形突起（Finger-like protrusions）(图2A-C)。有意思的是，相较于野生型，myomaker^-/-和myomixer^-/- 肌细胞融合缺陷突变体中，都呈现明显的手指形突起数目增加的表型，此外在 myomixer^-/-突变体中，手指形突起入侵深度显著大于野生型。

先前在果蝇中的研究表明完成细胞融合主要需要三个步骤: 细胞间的识别 （Recognition）和粘附 （Adhesion），肌动蛋白细胞骨架在融合突触处形成推力和阻力(Pushing and resisting forces)，和脂质双分子层失稳 (Lipid bilayer destabilization) 导致的细胞膜混合 (Membrane mixing）及融合孔的形成（Fusion pore formation），最终完成融合过程。在整个过程中，一系列蛋白和分子起到作用，如细胞粘连分子（Cell adhesion molecule），肌动蛋白细胞骨架调节分子（actin cytoskeletal regulators），融合剂（Fusogens）等等，任何步骤出现问题，都有可能会导致细胞融合失败。在斑马鱼中同样也鉴定出肌细胞粘连分子 Jam2a 和 Jam3b，两者基因突变都表现出细胞融合缺陷。与野生型对比发现在 jam2a^-/-  和 jam3b^-/- 突变体中，F-actin foci 数量显著减少。而过表达 Jam2a 和 Jam3b 都能显著拯救融合缺陷表型，同时拯救F-actin foci数量。有趣的是，过表达显性缺失突变（dominant negative）实验发现，Jam2aΔC 不能拯救 jam2a^-/- 融合缺陷表型，而过表达 Jam3bΔC 能够挽救 jam3b^-/- 表型以及 F-actin foci 数量。因此细胞粘连分子 Jam2a 被认为是 F-actin foci 形成的主要组织者，而非 Jam3b 蛋白。细胞定位实验证实，Jam2a 和 Jam3b 部分重合或毗邻 F-actin foci，它们的反式结合促成融合突触的形成。

WASP 和SCAR 蛋白一起被称为肌动蛋白成核促使因子（actin nucleation-promoting factors)。它们能够与Arp2/3 复合物结合推进 G-actin 多聚化过程，在果蝇中被鉴定为是形成 F-actin 富集的 PLS 的重要蛋白。在斑马鱼中也存在同源的WASP 和SCAR/WAVE/WASF基因。果蝇 WASP 和 SCAR 家族都仅有一个成员，而斑马鱼每个家族都拥有四个成员。针对斑马鱼基因家族功能富余现象，研究者通过CRISPR/CAS9 技术系统敲除两个家族的所有基因，并成功构建了单基因，双基因，三基因以及四基因敲除突变，从而发现wave2/wave3b 双敲除能够显著呈现细胞融合缺陷，同时显著降低 F-actin foci 的形成；而WASP 家族中，三敲除n-waspa/n-waspb/wasp1 能够显著降低细胞融合，减少 F-actin foci 的形成。有意思的是，多突变以及拯救实验证实，n-waspa 在n-waspa/n-waspb/wasp1 缺失时，会发挥功能补偿效应。相较于 WASP，斑马鱼 WAVE 功能突变造成更加严重的细胞融合缺陷表型。综上所述，斑马鱼 WASP 和 WAVE 家族都能够促使肌肉细胞融合，WAVE 较 WASP 家族为更大贡献者。

此外融合剂蛋白 Myomaker 和 Myomixer 虽然是细胞融合所必须的，但是两者功能缺失不仅不能阻止 F-actin foci 的形成，相反形成更大的 foci 结构以及更长的存在时间，因此融合剂蛋白 Myomaker 和 Myomixer 发挥作用于 F-actin foci 形成之后。斑马鱼Myomaker 和Myomixer目前都缺乏有效抗体，添加荧光蛋白标签，Myomaker-fluorescence 失去活性，无法拯救 myomaker^-/-缺陷表型，因此无法用于细胞定位实验；而 Myomixer-fluorescence  能够拯救 myomixer^-/- 缺陷表型，因此被用于后续细胞定位实验。Myomixer-fluorescence 融合蛋白以点状模式定位于快肌细胞的细胞膜和细胞质当中。在融合突触上没有观察到高水平的 Myomixer 富集，表明 Myomixer 不是特异地被招募到融合位点。然而，每个 fusion focus 与几个 Myomixer 小点相关联，表明每个融合 focus 在其生命周期内能够在细胞膜上遇到多个 Myomixer 蛋白微簇。因此，融合蛋白(至少Myomixer)在整个细胞膜上形成小区域微簇，那些与融合突触汇合的蛋白会促进融合孔的形成。

此项工作为脊椎动物肌细胞融合机理的研究奠定了坚实基础。德克萨斯大学西南医学中心的罗舟博士和石军博士为论文的共同第一作者，石军博士与导师Elizabeth Chen 教授为论文共同通讯作者。