葛伟团队进一步揭示生殖调控多面手AMH在控制斑马鱼性腺发育稳态中的双重功能及其作用机理

撰文 | 张志伟

      性腺发育和配子发生是生物体发育过程中的重要环节之一。多年以来的研究表明，以下丘脑-垂体-性腺轴为中心的内分泌调控，以及生殖细胞与性腺体细胞之间的旁分泌相互作用，协同促进并维持性腺发育和生殖细胞生成的内稳态平衡（homeostasis）。在这一复杂的调控网络中，由垂体分泌的促性腺激素是公认的控制脊椎动物性腺发育并维持生殖功能稳定的核心。澳门大学健康科学学院葛伟研究团队专注于以斑马鱼为模式动物，对下丘脑-垂体-性腺轴进行了大量的研究，不断完善理解这一复杂的调控系统。该团队在2015年连续发表文章，详细阐述了促性腺激素（FSH，follicle-stimulating hormone 和LH, luteinizing hormone）及其受体（FSHR 和LHCGR）在斑马鱼性腺发育中的关键作用[1, 2]。

      抗缪勒管激素（AMH，anti-Mu?llerian hormone）在哺乳动物生殖发育中具有多种功能。在性腺分化早期，由未成熟Sertoli细胞释放的AMH诱导缪勒氏管的退化，这一过程对于雄性发育至关重要。另一方面，在卵巢中AMH主要由窦前卵泡和早期窦卵泡的颗粒细胞（granulosa cell）分泌，调控原始卵泡（primordial follicle）的募集和优势卵泡的筛选。近年来，AMH在临床卵巢储备功能评估，以及女性生殖障碍（多囊卵巢综合征，PCOS）诊疗中的应用价值日益凸显。

      硬骨鱼类生殖系统发育过程中不存在缪勒氏管结构，因而AMH/Amh的功能研究基本局限于其在鱼类性腺分化以及性别决定中的作用。2017年，葛伟团队提出Amh作为性腺体细胞分泌的激素，可能受到卵母细胞分泌的生长因子Gdf9（growth differentiation factor 9）调控，从而提出Gdf9-Amh-Cyp19a1a这一生殖细胞与体细胞相互作用，进而调控早期性腺分化的假设[3]。借助CRISPR/Cas9技术构建的敲除模型，该团队于2020年上半年发表文章Anti-Mu?llerian hormone (Amh/amh) plays dual roles in maintaining gonadal homeostasis and gametogenesis in zebrafish，系统地分析了Amh在斑马鱼生殖发育过程中的功能，提出了Amh在控制雌雄配子发生过程中发挥双重控制作用的假说，即Amh抑制早期生殖细胞的增殖，但同时促进生殖细胞的分化（精细胞减数分裂和卵泡激活）[4]。Amh的这一双控作用一方面控制早期生殖细胞供应，另一方面确保配子发生过程的持续进行，以维持性腺配子发生的稳态，从而源源不断地提供成熟的精子和卵细胞（图1）。

图1  Amh调控斑马鱼配子发生和性腺发育稳态的模型

      近日，该研究团队在Development上发表文章Genetic evidence for Amh modulation of gonadotropin actions to control gonadal homeostasis and gametogenesis in zebrafish and its noncanonical signalling through Bmpr2a receptor，进一步阐述了在斑马鱼中Amh通过抑制促性腺激素及其受体的信号传导，而达至参与调控性腺生殖稳态和配子发生的作用。

      基于斑马鱼遗传操作的便利性以及该团队前期工作的积累，作者构建了不同的突变组合: amh^-/-;fshb^-/-，amh^-/-; fshr^-/- 和amh^-/-; fshr^-/-; lhcgr^-/-。对这些组合的表型分析显示，斑马鱼Amh敲除引起的早期生殖细胞过度增殖完全依赖于促性腺激素信号通路 （图2），从而揭示Amh在正常斑马鱼性腺内扮演着抑制促性腺激素信号应答的角色，这与AMH在哺乳动物中的作用有一定的类似，说明这一功能的进化保守性。

图2 Amh作用对促性腺激素信号传导的依赖性。敲除促性腺激素受体（fshr和 lhcgr）完全消除amh突变导致的性细胞过度增殖和性腺肥大。

      该项研究的另一重要发现是有关Amh受体。一直以来，斑马鱼中Amh的同源二型受体Amhr2都未能被发现，这限制了斑马鱼Amh信号通路的功能研究。葛伟团队通过序列比对分析，发现BMP (bone morphogenetic protein) 的二型受体Bmpr2a/Bmpr2b与Amhr2同源关系较近，进而分别构建了Bmpr2a和Bmpr2b的突变品系。表型分析发现Bmpr2a突变体具有和Amh几乎完全一致的缺陷表型，包括性细胞过度增殖导致的性腺肥大、性细胞分化降低、以及垂体FSH（fshb）的表达下降等。与Bmpr2a不同， Bmpr2b突变主要影响卵泡的生长和成熟，和Amh突变体没有没有任何共同性。作者由此推测，Bmpr2a很有可能就是斑马鱼中未被发现的Amh二型受体（图3）。

图3 Bmpr2a突变显示和Amh突变完全相同的表现型，包括精原细胞过度增殖导致的精巢肥大，卵巢中初级生长卵泡（PG）增殖，
以及垂体fshb表达的下降。

图4 促性腺激素通路与Amh相互作用调控斑马鱼性腺发育稳态的模型。

      澳门大学博士后张志伟为论文的第一作者，葛伟教授为论文的通讯作者。

参考文献：

1. Zhang,Z., B. Zhu, and W. Ge, Genetic analysis of zebrafish gonadotropin(FSH and LH) functions by TALEN-mediated gene disruption. Mol Endocrinol 2015. 29(1): p.76-98.

2. Zhang,Z., et al., Disruption of Zebrafish Follicle-Stimulating Hormone Receptor (fshr)But Not Luteinizing Hormone Receptor (lhcgr) Gene by TALEN Leads to Failed Follicle Activation in Females Followed by  Sexual Reversal to Males. Endocrinology 2015. 156(10): p. 3747-62.

3. Chen,W., L. Liu, and W. Ge, Expression analysis of growth differentiation factor 9 (Gdf9/gdf9), anti-mullerian hormone (Amh/amh) andaromatase (Cyp19a1a/cyp19a1a) during gonadal differentiation of the zebrafish,Danio reriodagger. Biol Reprod 2017. 96(2): p. 401-413.

4. Zhang,Z., et al., Anti-Mullerian hormone (Amh/amh) plays dual roles in maintaining gonadal homeostasis and gametogenesis in zebrafish. Mol Cell Endocrinol 2020. 517: p. 110963.