孟安明团队建立斑马鱼胚胎内源mRNA成像的新方法

作者：luojiao 发布时间：2021/4/2 10:00:00

撰文 | 张琳

RNA不对称分布现象广泛存在于多种模式生物中，在细胞运动、胚层诱导及轴线建立等过程中发挥重要作用。荧光标记技术、MCP/MS2系统和CRISPR/Cas系统等成像技术的发展实现了活细胞内mRNA分子的可视化及动态追踪。

Mini-III蛋白（mR3）是核酸内切酶RNase III家族的成员之一，能够以一定的序列特异性识别并切割长双链RNA（dsRNA）底物。而核酸酶失活型的Mini-III蛋白不具有底物切割活性，却能以序列非依赖性的方式结合双链RNA底物。失活型Mini-III蛋白的这种特性预示其可能被应用于内源mRNA分子的定位成像。

近日，清华大学孟安明团队在Development上发表题为“Mini-III RNase-based dual-color system for in vivo mRNA tracking”的研究论文。论文将表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）来源的失活型Mini-III蛋白（dSmR3）与反义RNA探针相结合，建立了非工程化内源mRNA实时成像的新方法，即mR3/dsRNA成像系统。

研究中，作者将体外合成的反义RNA探针与带有GFP标记的dSmR3nd蛋白依次注射到斑马鱼胚胎内，通过RNA免疫共沉淀检测证明反义RNA探针能够与其靶点mRNA分子互补形成dsRNA并结合dSmR3nd-GFP，而且dSmR3nd-GFP的结合会挽救反义RNA探针单独注射所造成的靶点表达水平的降低（图1）。

图1 失活型Mini-III蛋白在斑马鱼胚胎内具有dsRNA结合能力

通过对荧光反义RNA探针标记内源mRNA的效率进行比较、优化后，作者将靶向到actb2 mRNA的荧光反义RNA探针actb2-as-P3与dSmR3nd-mCherry蛋白依次注射到斑马鱼胚胎内，并在四细胞期进行活体成像。成像结果显示，荧光反义RNA探针actb2-as-P3能够与内源actb2 mRNA互补形成荧光点状信号，而且这些点状信号可部分被dSmR3nd-mCherry蛋白结合形成双色共定位信号，这些共定位信号随着胚胎发育呈现出动态的运动，代表母源actb2 mRNA分子在胚胎内的动态（图2）。其次，通过在胚胎内注射dSmR3nd-mCherry蛋白和持续表达actb2-as-P3探针的质粒可以实现对合子表达的actb2 mRNA的实时动态成像（图2）。

图2 dSmR3nd-mCherry蛋白用于斑马鱼内源mRNA的标记成像

该研究建立的mR3/dsRNA成像系统可实现斑马鱼胚胎内非工程化内源mRNA的双色标记，为mRNA的动态成像提供了新方法，有助于了解内源mRNA在胚胎发育过程中的动态。作者提到，使用该系统，需要用靶mRNA不同区域设计反义RNA探针，找到合适的区域；同时应以正义RNA探针或突变体胚胎做为对照，以确定信号的特异性。此外，该方法仅能标记细胞中的少量mRNA，可能受到靶mRNA的构象变化或其与蛋白的动态结合的影响。mR3/dsRNA系统的标记效率和标记的特异性，尚有待进一步提高。

清华大学张琳博士为该研究第一作者，孟安明教授为通讯作者，该研究得到了国家自然科学基金的资助。

参考文献：

1. Abudayyeh,O.O., Gootenberg, J.S., Essletzbichler, P., Han, S., Joung, J., Belanto, J.J.,Verdine, V., Cox, D.B.T., Kellner, M.J., Regev, A., et al. (2017). RNA targetingwith CRISPR-Cas13. Nature 550, 280-284.

2. Bertrand,E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S.M., Singer, R.H., and Long, R.M.(1998). Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell 2,437-445.

3. Glow,D., Pianka, D., Sulej, A.A., Kozlowski, L.P., Czarnecka, J., Chojnowski, G.,Skowronek, K.J., and Bujnicki, J.M. (2015). Sequence-specific cleavage of dsRNAby Mini-III RNase. Nucleic Acids Res 43, 2864-2873.

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