华南理工大学医学院发育与再生医学团队揭示Runx1在中性粒细胞成熟过程中的调节机制

作者：luojiao 发布时间：2021/4/2 11:00:00

撰文 | 黄志斌

中性粒细胞作为血液中最丰富的吞噬细胞，是先天免疫系统中必不可少的第一道防线。成熟的中性粒细胞在杀灭和消化病原体、对损伤做出反应和介导炎症反应中发挥了重要作用，它们最早到达损伤和炎症部位，具有很强的趋化性和吞噬功能，在感染时趋化至感染部位，依赖丰富的颗粒酶、活性氧、中性粒细胞外诱捕网等杀灭外来物质[1]。中性粒细胞的定向分化、发育和成熟是一系列复杂而有序的动态过程，要经过严密的转录因子调控才能得以实现。其中任何一个环节发生错误，都将引起中性粒细胞的数量、分布和功能异常，从而引起各类血液疾病，如先天性中性粒细胞减少症（congenital neutropenia，CN）、白细胞黏附缺陷（leukocyte adhesion deficiency，LAD）、慢性肉芽肿（chronic granulomatous disease，CGD）、骨髓增生异常综合症（Myelodysplastic syndrome，MDS）和白血病等[2-5]。因此，了解中性粒细胞如何正常分化为功能成熟细胞及迁移到损伤或炎症部位并发挥正常吞噬杀伤功能将有助于开发治疗中性粒细胞相关疾病的新治疗策略。

在造血过程中，RUNX1参与造血干细胞的形成有大量报道 [6, 7]。RUNX1在巨噬细胞/中性粒细胞的命运决定[8]以及巨核细胞和淋巴细胞的成熟过程[9-11]中也发挥了重要作用。此外，值得注意的是，RUNX1是各种血液系统恶性肿瘤中最常见的突变基因之一，如急性髓系白血病（Acutemyeloid leukemia，AML）和家族性血小板疾病(Familialplatelet disease,FPD) [12,13]。RUNX1突变在多种血液学恶性肿瘤中的高发生率为其在血液谱系发育中的重要作用提供了有力证据。目前，已经发现了50多个影响RUNX1功能的染色体易位，其中大多数导致髓系细胞成熟停滞甚至进展为白血病[14]。虽然RUNX1在造血发育和血液恶性肿瘤中有大量报道，但RUNX1在中性粒细胞成熟和髓系白血病发生和发展中的机制和靶基因，以及如何将它们用于开发针对这类患者的潜在靶向治疗是目前亟需回答的问题。

2021年1月9日，华南理工大学发育生物学与再生医学团队在Journal of Biological Chemistry在线发表了题为“Runx1 regulates zebrafish neutrophil maturation via synergistic interaction with c-Myb”的研究论文。该研究以斑马鱼为模式生物，研究Runx1在体内的作用及其与c-Myb在调节中性粒细胞成熟中的相互作用。通过遗传和生化分析，他们发现Runx1在中性粒细胞成熟过程中与c-Myb通过协同激活一系列中性粒细胞成熟相关基因来控制发育过程。

成熟中性粒细胞的特征是细胞质中有丰富的颗粒，可被苏丹黑B（SB）特异性染色[8, 15]。与原始髓系过程中c-myb^-/-突变体的表型相似[16]，runx1^-/-突变体在受精后36小时（36 hpf）SB+中性粒细胞数量[8]和信号强度均减少（图1A-D）。使用微分干涉相差显微镜（DIC）[17]也可以在活体状态下观察到runx1^-/-突变体中中性粒细胞颗粒相比对照组减少（图1E-F, E'-F'和G-I）。另外，成熟和未成熟的中性粒细胞也可以通过May-Grunwald Giemsa染色来定量分析（图1J-K）。这些数据表明斑马鱼的中性粒细胞受到runx1突变的影响。

图1 runx1突变影响中性粒细胞成熟

为了确定runx1与c-myb在中性粒细胞成熟中的作用，他们比较了runx1和c-myb单突变体与c-myb、runx1双突变体的中性粒细胞表型。当一个c-myb^+/-等位基因被引入runx1^-/-时，SB染色和DIC观察实验均表明c-myb^+/-; runx1^-/-引起更多的不成熟的特点（图2A-B）。为了确定c-Myb和Runx1的协同调控是否对中性粒细胞功能产生生物学影响，他们检测了各组中性粒细胞对细菌的杀灭率。正如预期的那样，c-myb^+/-的加入进一步削弱了runx1^-/-对细菌的杀灭活性。与哺乳动物类似，斑马鱼的中性粒细胞成熟也需要正常产生中性粒细胞颗粒相关蛋白和消化酶，如Lyz、Mpx、Npsn和Srgn [18, 19]。当引入c-myb^+/-时，runx1^-/-突变体中lyz+细胞进一步减少，同样， mpx、npsn和srgn也进一步减少（图2C-F）。

图2 c-myb和runx1协同调控中性粒细胞成熟

对以上四个基因的启动子调控区进行了分析，通过ChIP-PCR和GFP荧光报告实验表明这些中性粒细胞特异性基因分别受到c-Myb和Runx1的直接调控。而免疫共沉淀（Co-IP）实验则表明Runx1和c-Myb可通过相互结合来发挥作用。

图3 c-Myb和Runx1通过相互结合共同促进中性粒细胞特异性基因转录

综上所述，活体实验及生化实验表明Runx1的在中性粒细胞成熟过程中的调节机制（图4）。这项研究将提高我们对RUNX1在中性粒细胞相关疾病的发病机制的认识。

图4 斑马鱼中c-Myb和Runx1调控中性粒细胞发育的模式图

华南理工大学黄志斌副教授和博士生陈克敏同学为该论文共同第一作者，张译月教授为论文通讯作者。该项目获得国家重点研发计划（2018YFA0800200，2018YFA0801000）、国家自然科学基金(31922023）、广东省高等学校珠江学者岗位计划资助（2019）等项目资助。据悉，该研究涉及的部分斑马鱼品系将保藏至国家水生生物种质资源库国家斑马鱼资源中心。

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