当前位置：首页 > 详细信息 澳门大学罗茜组构建斑马鱼模型实现在单细胞水平实时观察NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用
作者：luojiao 发布时间：2022/8/22 9:00:00
近年来，肿瘤免疫治疗取得了十分重要的进展。基于T细胞和CAR T细胞的疗法已经在临床上用于多种肿瘤的治疗。然而，T细胞疗法存在细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome）和移植物抗宿主病（graft versus host disease）等副作用。作为另外一种策略，基于NK细胞的肿瘤免疫疗法逐渐吸引业界的关注。NK细胞可以不经过抗原识别直接杀伤肿瘤细胞。相较T细胞而言，基于NK细胞的疗法对健康组织的免疫攻击更不易发生，副作用更小。为了增强NK细胞的杀伤效果，多种新型的治疗性NK细胞正在被开发出来，比如脐带血NK细胞，干细胞来源NK细胞，过继性NK细胞，细胞因子诱导的记忆样NK细胞和CAR NK细胞等。这些新型的治疗性NK细胞的杀伤效果需要合适的动物模型来评价，可靠且简便的动物模型能够有效地促进NK细胞疗法的开发。
NK细胞主要通过死亡受体途径（death receptor pathway）和杀伤性颗粒途径（cytotoxic granule pathway）介导的细胞凋亡来杀死肿瘤细胞。传统常用的评价NK细胞杀伤效果的方法为铬释放试验（chromium release assay）。该方法采用放射性同位素铬标记靶细胞，靶细胞被NK细胞杀死后，根据靶细胞释放的铬来判断NK细胞的杀伤活性。铬释放试验可以较为准确的测定NK细胞对靶细胞的杀伤，但是，铬的放射性影响了该方法的使用。鉴于此，具有荧光的钙黄绿素（calcein）被用来替代铬进行细胞标记。然而，钙黄绿素对有些细胞的标记较差，且随着细胞的增殖荧光会被稀释，故不适合长时程跟踪。
罗茜团队在之前的研究中，利用基因工程技术，开发了一种基于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的蛋白荧光探针sensor C3用于细胞凋亡的实时跟踪。该探针在活细胞中发出绿色荧光，而在凋亡细胞中，构成sensor C3的CFP和YFP之间的氨基酸序列被活化的caspase-3切割，FRET被中断，从而探针发出蓝色荧光。本研究中，基于sensor C3，并结合循环系统标记的斑马鱼Tg(fli1:EGFP)，该团队建立了一种可以在体内实时地观察肿瘤细胞扩散和NK细胞杀伤的动物模型。作为一种强大的体内工具，该模型可以用来评价基于NK细胞的免疫疗法的治疗效果。2022年8月6日，此项研究以“Visualization of natural killer cell-mediated killing of cancer cells at single-cell resolution in live zebrafish” 为题发表于国际知名期刊Biosensors and Bioelectronics上。
作者首先建立了体外3D培养模型来研究NK细胞对肿瘤细胞的杀伤（图1）。作者使用sensor C3标记肿瘤细胞，红色荧光蛋白（tdTomato）标记NK-92MI细胞，肿瘤细胞和NK细胞混合后，共同培养在非贴壁孔板。结果显示，在肿瘤细胞单独培养的对照组，很少出现蓝色的凋亡细胞。而在共培养组，6小时后即出现大量凋亡细胞，36小时后，肿瘤细胞几乎全被NK细胞杀死。
图1 体外3D培养模型显示NK细胞可以诱导肺癌细胞凋亡
图1 体外3D培养模型显示NK细胞可以诱导肺癌细胞凋亡
然后，作者将肿瘤细胞和NK细胞通过显微注射的方法在总主静脉（common cardinal vein, CCV）处注射到斑马鱼幼鱼。注射后6小时，可以看到肿瘤细胞分散到躯干和尾部。在肿瘤细胞单独注射对照组，很少有蓝色凋亡细胞，而在共注射组，有大量凋亡细胞（图2A）。统计结果显示，肿瘤细胞凋亡的峰值出现在注射后12小时，且NK细胞可以在36小时内几乎杀死全部肿瘤细胞 （图2B, C）。
图2 斑马鱼肿瘤模型显示NK细胞对肺癌细胞的杀伤
图2 斑马鱼肿瘤模型显示NK细胞对肺癌细胞的杀伤
大视野全身成像技术展示了显微注射8小时后，肿瘤细胞在斑马鱼体内的分布和NK细胞对肿瘤细胞的杀伤 （图3A）。而高分辨率成像则更好地展示了NK细胞和肿瘤细胞的相互作用。比如，NK细胞会紧密地粘附肿瘤细胞，甚至会改变自己的形态来更好地杀伤肿瘤细胞（图3B）。
图3 大视野和高分辨成像显示NK细胞对肺癌细胞的杀伤
图3 大视野和高分辨成像显示NK细胞对肺癌细胞的杀伤
为了研究NK细胞杀伤肿瘤细胞的动态过程，作者进行了实时成像（图4）。如图所示，在显微注射4小时10分钟后，一个NK细胞识别到一个乳腺癌细胞， 35 分钟后，该乳腺癌细胞开始由绿变蓝，意味着caspase-3的活化。4小时55分钟后，肿瘤细胞彻底变为蓝色，同时NK细胞开始迁移向另外一个肿瘤细胞。
图4 实时成像显示NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤
图4 实时成像显示NK细胞对乳腺癌细胞的杀伤
澳门大学健康科学学院罗茜教授为论文通讯作者，博士研究生杨红梅和博士后研究员贾皓为论文共同第一作者，赵琦教授参与了相关研究工作。澳门大学健康科学学院动物研究核心实验中心和生物成像及干细胞核心实验中心提供了重要支持。这项研究得到了澳门大学MYRG研究基金和澳门大学健康科学学院的资助。