当前位置：首页 > 详细信息 华中科技大学刘木根组揭示Dhx38通过可变剪接调控斑马鱼红髓系祖细胞和造血干细胞的增殖与分化
作者：luojiao 发布时间：2022/9/2 9:00:00
哺乳动物次级造血发育包括红髓系祖细胞（erythro-myeloid progenitors, EMP）和造血干细胞（hematopoietic stem and progenitor cells, HSPC）发育和分化过程[1]。EMP在胚胎4周左右产生并在胎肝生成第一个有功能的单核细胞和独特的胎儿血红蛋白，维持胚胎在出生之前的存活。HSPC在主动脉-性腺-中肾生成后先迁移至胎肝，而后迁移至骨髓维持成体的主要血细胞供应 [1]。EMP和HSPC均起源于生血内皮并在胎肝进行初步的增殖和分化，其发育过程具有相似和不同的调控机制，且具有一定的时空重叠[2-3]。近年来，转录及转录后调控、表观遗传修饰等参与HSPC的发生以及维持的报道日益增多，而EMP发育及其与HSPC发育调控的关联性方面的研究则少见报道。
可变剪接（alternative splicing，AS）是其中一种关键的转录后调控机制，通过对pre-mRNA的不同剪接，极大地提高mRNA和功能蛋白的多样性。近年来对造血过程中剪接事件日益得到越来越多的关注。在人类血液细胞发育过程中，有多达60%的基因被预测存在可变剪接 [4]。超过50%的骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes, MDS）患者中都存在几种RNA剪接因子的突变 [5]。提示剪接因子在造血系统正常发育和功能维持中发挥重要的生理功能，剪接因子调控EMP和HSPC自我更新以及分化的机制仍需探索。
Dhx38（DEAH-box RNA helicase），又名Prp16，在剪接过程的分支点移除和外显子连接中发挥作用 [6]。其功能异常将会使基因处于分支套索状态从而无法完成外显子的连接，导致内含子的保留进而诱发疾病产生。在人类Dhx38突变可引起常染色体隐性视网膜色素变性 [7]，但由于胚胎致死，该基因突变引起视网膜感光细胞退行性病变的致病机制还缺乏研究。2006年Ma等在一篇会议摘要报道Dhx38在急性髓细胞白血病中富集表达[8] ，分析GEPIA数据库发现Dhx38在弥漫性大B细胞淋巴瘤和胸腺瘤中高表达。但目前还未见关于DHX38基因在血液细胞发育和分化方面的研究。
近日，华中科技大学刘木根教授课题组在Development上发表了题为“Dhx38 regulates the maintenance and differentiation of erythro-myeloid progenitors and hematopoietic stem cells by alternative splicing”的研究论文。该研究揭示了剪接因子Dhx38通过影响有丝分裂相关基因的可变剪接调控斑马鱼红髓系祖细胞和造血干细胞的增殖与分化。
该研究发现Dhx38可在PBI（相当于哺乳动物胎肝）处表达，并可与cmyb+（代表造血干细胞HSPC和红髓系祖细胞EMP）细胞共定位，提示了其在血液发育系统的重要作用。该研究通过构建Dhx38敲除斑马鱼观察和分析Dhx38参与造血系统发育过程和调控机制。对dhx38突变体和野生型斑马鱼的红髓系祖细胞（cmyb+gata1+）和造血干细胞(cmyb+gata1-)观察分析，发现dhx38突变体36-48hpf时期的EMPs和HSPCs均出现异常累积，而下游成熟血细胞数目的减少，提示敲除dhx38会导致次级造血过程出现无效造血。dhx38敲除进而引起56 hpf时期斑马鱼的EMPs和HSPCs数目急剧减少，P53依赖的凋亡信号显著升高 (图1)。
图1 红髓系祖细胞（EMPs，黄色）和造血干细胞（HSPCs，绿色）在48 hpf和56 hpf的荧光数目统计
图1 红髓系祖细胞（EMPs，黄色）和造血干细胞（HSPCs，绿色）在48 hpf和56 hpf的荧光数目统计
为明确36-48 hpf EMP和HSPC增多的原因，研究者进行有丝分裂观察和凋亡检测，发现dhx38突变体斑马鱼处于细胞周期S期的EMPs和HSPCs数目显著减少，而处于M期的EMPs和HSPCs数目显著增多。利用共聚焦成像进一步观察有丝分裂过程，显示野生型斑马鱼EMPs（cmyb+gata1+）和HSPCs（cmyb+gata1-）可以进行正常的有丝分裂，但dhx38突变体的有丝分裂不能正常完成，并呈现出一些异常的染色体核型，伴随着逐渐无规则的纺锤体形态（图2）。这种异常现象在有丝分裂中期体现的最为明显，野生型胚胎EMPs和HSPCs在分裂中期呈现出典型的染色质排列在赤道板上，纺锤体两极发出的微管附着于染色体的着丝点。而dhx38突变体胚胎虽然呈现出基本的纺锤丝形态，但染色质并不能正常排列在赤道板而呈现凌乱分布（*表示）。
图2 dhx38突变体斑马鱼呈现有丝分裂异常表型
图2 dhx38突变体斑马鱼呈现有丝分裂异常表型
为阐明敲除dhx38导致有丝分裂异常背后的机制，研究者对dhx38野生型和突变体斑马鱼尾部PBI区域进行了RNA-seq。RNA-seq数据提供了550个差异表达基因和966个差异剪接基因。对差异表达基因的GO富集显示，表达上调的基因GO富集呈现出了p53的上调（DRE04115），提示该通路的激活可能是后续EMP和HSPC下降的原因。与cenpa有关的着丝粒组件（R-DRE606679）表达下降，则可能是着丝粒相关功能受损和染色质分离异常表型出现的原因。
由于Dhx38参与调控剪接的过程，对野生型和dhx38突变体斑马鱼的差异剪接基因的分析，发现最主要的差异剪接表现在SE事件的PSI 下降（650/966）和RI事件的PSI上升（145/966），提示dhx38突变导致一些关键靶基因的外显子跳跃和内含子保留事件的增加。通过对相关基因的定量和半定量检测，研究者确定了异常剪接同时mRNA表达下调的基因21个。其中mis18a、cenpk、kdm8、smc5和knl1主要介导有丝分裂过程的染色质分离，它们的功能丧失同样导致有丝分裂停滞在前中期并伴随着异常的染色质核型；而scrib、ift20、cep131、lzts2a、sept6a、mak、pard3ab主要参与调控微管骨架的正常功能，且参与调控正常的有丝分裂过程。另外细胞周期激酶ccng2、ccnb2、aaas以及调控DNA损伤的dtl、trip12、rad9a、eme1、tonsl、recql基因同样存在显著的变化（图3）。这些结果提示DHX38可能通过调控多种关键靶基因，维持细胞分裂和细胞周期的正常进行。
图3 dhx38突变体中的与有丝分裂相关的差异剪接基因分析
图3 dhx38突变体中的与有丝分裂相关的差异剪接基因分析
在先前的研究中，刘木根课题组在blood期刊发表了剪接因子BCAS2通过调节Mdm4的剪接，在斑马鱼造血干细胞发育和维持中发挥重要作用 [9]。该论文则研究另一个剪接因子Dhx38在红髓系祖细胞和造血干细胞发育中的作用机制，揭示该基因通过相关基因的前体mRNA的剪接调控有丝分裂，以及通过调控p53信号通路，在斑马鱼胚胎发育早期维持血液细胞的正常发育和分化。
图4 剪接因子Dhx38调控红髓系祖细胞EMPs和造血干细胞HSPCs的发育
图4 剪接因子Dhx38调控红髓系祖细胞EMPs和造血干细胞HSPCs的发育
华中科技大学生命科学与技术学院博士研究生涂佳依和于珊珊博士后为本论文的并列第一作者，刘木根教授和卢群伟教授为共同通讯作者。该论文得到国家重点研发计划和自然科学基金项目资助。该研究涉及的斑马鱼品系，将保藏至国家水生生物种质资源库国家斑马鱼资源中心。
参考文献
参考文献
1. Frame JM, McGrath KE, Palis J: Erythro-myeloid progenitors: "Definitive" hematopoiesis in the conceptus prior to the emergence of hematopoietic stem cells. Blood Cell Mol Dis 2013, 51(4):220-225.
2. Bertrand JY, Cisson JL, Stachura DL, Traver D: Notch signaling distinguishes 2 waves of definitive hematopoiesis in the zebrafish embryo. Blood 2010, 115(14):2777-2783.
3. Hoeffel G, Chen JM, Lavin Y, Low D, Almeida FF, See P, Beaudin AE, Lum J, Low I, Forsberg EC et al: C-Myb(+) Erythro-Myeloid Progenitor-Derived Fetal Monocytes Give Rise to Adult Tissue-Resident Macrophages. Immunity 2015, 42(4):665-678.
4. Chen L, Kostadima M, Martens JHA, Canu G, Garcia SP, Turro E, Downes K, Macaulay IC, Bielczyk-Maczynska E, Coe S et al: Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science 2014, 345(6204):1251033.
5. Pellagatti, A. and Boultwood, J. (2020). Splicing factor mutant myelodysplastic syndromes: Recent advances. Adv Biol Regul 75, 100655.
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7. Ajmal M, Khan MI, Neveling K, Khan YM, Azam M, Waheed NK, Hamel CP, Ben-Yosef T, De Baere E, Koenekoop RK, Collin RW, Qamar R, Cremers FP. A missense mutation in the splicing factor gene DHX38 is associated with early-onset retinitis pigmentosa with macular coloboma. J Med Genet. 2014 Jul;51(7):444-8.
8. Ma Y, Barnett T, Chai L, Yang JC, Alipio Z, Pei L, Amin HM, Fink L, Di CH, Yan H: DEAH-box splicing factor gene, prp16 amplification in acute myeloid leukemia. Blood 2006, 108(11):198b-198b.
9. Yu S, Jiang T, Jia D, Han Y, Liu F, Huang Y, Qu Z, Zhao Y, Tu J, Lv Y, Li J, Hu X, Lu Z, Han S, Qin Y, Liu X, Xie S, Wang QK, Tang Z, Luo D, Liu M. BCAS2 is essential for hematopoietic stem and progenitor cell maintenance during zebrafish embryogenesis. Blood. 2019 Feb 21;133(8):805-815.