当前位置：首页 > 详细信息 华南理工大学徐进/张文清团队合作揭示V-ATPase亚基参与调控小胶质细胞的吞噬体成熟功能
作者：CZRC 发布时间：2024/6/17 9:00:00
在早期胚胎发育过程中，为了重塑脑组织并调节细胞数量，有大量的神经元发生程序性死亡。这些凋亡神经元和细胞碎片通常可被小胶质细胞有效识别并清除，从而防止降解产物破坏大脑并进一步维持中枢神经系统稳定。小胶质细胞本质是一类特化的巨噬细胞，通过细胞膜形变包裹并吞噬待降解物质继而生成吞噬体。吞噬体在胞内经过一系列加工逐步成熟并最终被靶向递送至溶酶体进行消化降解。其中，巨噬细胞维持消化降解功能以及介导吞噬体成熟过程均十分依赖于V-ATPase（vacuolar-type adenosine triphosphatase）提供必要的酸性环境。V-ATPase，又被称为质子泵，其主要的生物学功能为跨膜转运H+。V-ATPase是一种多亚基复合体，由胞外可游离的V1结构域和跨膜的VO结构域组装构成。其中，VO结构域的a亚基作为转运H+的重要通道，其功能一直备受关注。在哺乳动物中，V-ATPase a亚基存在四种亚型（a1、a2、a3、a4）。然而，V-ATPase a亚基的各类亚型在小胶质细胞发育过程中所扮演的角色，以及其在吞噬体成熟方面的作用尚未被明确阐明。
2024年6月14日，华南理工大学徐进教授团队与张文清教授团队合作在细胞自噬领域的国际权威期刊Autophagy上发表题为“The different roles of V-ATPase a subunits in phagocytosis/endocytosis and autophagy”的研究论文。该研究工作以斑马鱼为主要模型，报道了V-ATPase a1和a3亚基可差异性调控小胶质细胞的吞噬体成熟，溶酶体酸化和自噬功能。
研究人员在早期斑马鱼胚胎发育中发现atp6v0a1基因编码的V-ATPase a1亚基和tcirg1b基因编码的V-ATPase a3亚基均参与小胶质细胞发育。当任意V-ATPase a亚基缺失，小胶质细胞的吞噬体成熟过程会明显受影响，并最终导致吞噬体的异常堆积。相比野生型，在atp6v0a1-/-、tcirg1b-/-、atp6v0a1-/- tcirg1b-/-（double mutant，DM）三种基因型突变的斑马鱼中，均可观察到异常胀大的小胶质细胞（图1A-C）。
图1 V-ATPase a亚基缺失引起小胶质细胞“消化不良”。
图1 V-ATPase a亚基缺失引起小胶质细胞“消化不良”。
进一步研究发现V-ATPase a1亚基主要分布在早期和晚期吞噬体中（图2A-B），a1亚基的缺陷导致早期吞噬体向晚期吞噬体的成熟过程受阻（图2C-D）。
图2 V-ATPase a1亚基的亚细胞器定位和功能。
图2 V-ATPase a1亚基的亚细胞器定位和功能。
而V-ATPase a3亚基则主要定位于溶酶体（图3A-B），调节晚期吞噬体和溶酶体融合的过程（图3C-D）。
图3 V-ATPase a3亚基的亚细胞器定位和功能。
图3 V-ATPase a3亚基的亚细胞器定位和功能。
该研究进一步发现V-ATPase a1和a3亚基在小鼠Raw264.7巨噬细胞系中的亚细胞器定位和功能与斑马鱼小胶质细胞相同，提示这两个亚基具备跨物种保守性。
通过使用中性红染色以及溶酶体质子探针LysoSensor对小胶质细胞中的溶酶体酸化进行检测，结果显示：和野生型相比，atp6v0a1-/-突变体的小胶质细胞酸化几乎不受影响，但在tcirg1b-/-中酸化显著减弱（图4 A-C）。此外，atp6v0a1-/- tcirg1b-/-双突变体（double mutant）对酸化的影响最大，LysoSensor探针几乎检测不到细胞器的酸化（图4A下行）。数据结果提示：V-ATPase a3亚基是斑马鱼小胶质细胞的主要酸性调节元件，而非V-ATPase a1亚基。但双突变体的小胶质细胞溶酶体酸化相比于tcirg1b-/-突变体明显降低，意味着V-ATPase a1亚基也可能协同调节酸化。
图4 V-ATPase a1和a3亚基与溶酶体酸化。
图4 V-ATPase a1和a3亚基与溶酶体酸化。
进一步使用透射电子显射电镜（TEM）并分别观察了野生型、atp6v0a1-/-、tcirg1b-/-和双突变体的溶酶体的形态（图4 D）。TEM结果显示atp6v0a1-/-突变体中的溶酶体形态和密度与野生型胚胎相似。相反地，在tcirg1b-/-突变体中，可观察到一些形态胀大且密度较低的异常溶酶体（图4D下行，黄色箭头）。而在atp6v0a1-/- tcirg1b-/-双突变体中则存在较多未酸化的囊泡（图4D下行，蓝色箭头）。以上结果可能提示V-ATPase a3亚基的缺失会影响自噬，研究人员后续对自噬流进行了检测。
自噬活性的改变通常以Lc3的变化为标志信号。研究人员随后通过标记Lc3，并在斑马鱼小胶质细胞中对自噬活性进行检测。免疫荧光结果显示Lc3+信号在tcirg1b-/-突变体的小胶质细胞中大量积累（图5 A，黄色箭头），在野生型和atp6v0a1-/-胚胎中则未被观察到。为了进一步探究V-ATPase a3亚基突变对自噬流的影响，研究人员分别收集了4 dpf野生型和tcirg1b-/-突变体的斑马鱼头部组织进行免疫印迹分析，并检测了两种基因型斑马鱼的自噬通量。结果显示，tcirg1b-/-突变体中Lc3 I向Lc3 II的转化增强，Lc3 II水平明显升高，表明V-ATPase a3亚基缺失确实影响了自噬流（图5 C-D）。
图5 V-ATPase a3亚基缺失阻滞自噬过程。
图5 V-ATPase a3亚基缺失阻滞自噬过程。
综上，该研究结果揭示了V-ATPase a1和a3亚基在小胶质细胞的发育中发挥重要作用：参与吞噬体成熟、酸化和自噬过程的差异性调控（图6）。
图6 V-ATPase a1和a3亚基差异性调控吞噬体成熟，溶酶体酸化和自噬示意图。
图6 V-ATPase a1和a3亚基差异性调控吞噬体成熟，溶酶体酸化和自噬示意图。
该论文第一作者为华南理工大学博士生陈琪，通讯作者为华南理工大学徐进教授、华南理工大学张文清教授和华南理工大学黄志斌副教授。感谢华南理工大学王强教授、张译月教授、张美佳教授、中科院生物物理所张宏教授、清华大学俞立教授、云南大学杨崇林教授、法国巴斯德研究所Doris Lou Demy和Philippe Herbomel的共同指导。本研究项目受到国家重点研发项目基金、国家自然科学基金的大力支持。